成果概要：

果糖氨基酸氧化酶是测定糖化白蛋白（GA）的关键工具酶，用于催化由糖化白蛋白酶解而来的果糖氨基酸发生氧化反应生成氨基酸、葡萄糖醛酮和过氧化氢。由于液态果糖氨基酸氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其热稳定性是该酶大量应用的基础。提高酶稳定性的主要方法有蛋白质工程、固定化、化学修饰、添加酶保护剂等。添加酶保护剂是提高液态酶热稳定性的主要方法，常见的酶保护剂有牛血清白蛋白等蛋白质类、L-天门冬氨酸等氨基酸类、蔗糖等二元糖类、甘油等多元醇等物质。这些保护剂对单独存在的液态果糖氨基酸氧化酶有一定的稳定作用，但并不适合采用FAOD清除法的GA测定试剂中果糖氨基酸氧化酶的保存。在试剂中添加高浓度的牛血清白蛋白等蛋白质、L-天门冬氨酸等氨基酸虽然都可以在一定程度上提高果糖氨基酸氧化酶的热稳定性，但牛血清白蛋白等蛋白质本身也可被碱性蛋白酶所酶解，在检测时会降低碱性蛋白酶对血清糖化白蛋白的酶解作用，高浓度的L-天门冬氨酸等氨基酸则会阻碍碱性蛋白酶对血清糖化白蛋白的酶解反应，这两者均使酶解反应不到终点，降低检测的灵敏度和准确性；蔗糖、麦芽糖、果糖等二元糖在碱性缓冲液中长时间存储时，会逐渐水解释放出葡萄糖，葡萄糖具有较强的还原性，可明显降低检测的灵敏度；高浓度的甘油等多元醇对果糖氨基酸氧化酶有良好的稳定作用，但多元醇的还原性同样降低了检测灵敏度。现有的技术为提高FAOD清除法测定试剂中果糖氨基酸氧化酶的热稳定性，多数情况下都是加入大量的对GA检测无干扰的非专一性保护剂，未能解决液态糖化氨基酸氧化酶热稳定性不佳的缺点，另一方面，大量保护剂的加入导致测定试剂粘度较高，不利于在全自动生化分析仪上应用。

本发明针对现有技术的不足，建立了一种对FAOD清除法测定GA含量无干扰、可显著提高液态氨基酸氧化酶热稳定性的方法，该方法通过在含有果糖氨基酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、Trinder’S反应组分、防腐剂的碱性缓冲液中添加一定浓度的离子液体1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐（[BSMIM]OTf），联合非离子型表面活性剂TritonX-100和海藻糖的协同稳定作用，使液态果糖氨基酸氧化酶置4℃保存12个月仍保留足够的活性。

本发明提高液体果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法，是在下述基础上获得的：首选筛选出对FAOD清除法测定GA含量无干扰、能延长recombinant E.coli来源的果糖氨基酸氧化酶热稳定性的保护剂，并对得到的复合保护剂进行优化，最终获得了能显著提高recombinant E.coli来源的果糖氨基酸氧化酶稳定性的最佳保护剂配比。采用本发明的方法，使得recombinant E.coli来源的果糖氨基酸氧化酶热稳定性显著提高，可很好地应用于FAOD清除法测定GA的测定试剂开发。

项目联系人：连国军  副教授

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